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同位素法測定底物磷酸化活性方法

閱讀次數(shù):1779   發(fā)布時間:2012/9/27 13:48:11

磷酸化的底物

史葛·艾伯林,N庫馬爾,邁克爾J韋伯

微生物學(xué)系和癌癥中心,弗吉尼亞大學(xué)衛(wèi)生系統(tǒng),夏洛茨維爾,弗吉尼亞州22908

摘自蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用,第二版

編輯golemis彼得·亞當(dāng)斯·A。

摘要

理想的情況下,人們希望能夠直接磷酸化的基板在一個完整的細胞這可能是通過引入居住或透細胞三磷酸腺苷的模擬。然而,細胞是不透水的三磷酸腺苷并增加標(biāo)記的三磷酸腺苷模擬毛地黃皂苷-透細胞結(jié)果的水解三磷酸腺苷模擬1分鐘內(nèi)喬杜里等人。2002。因此,我們選擇了應(yīng)用此技術(shù)的細胞裂解物或分數(shù)。在這里,我們描述的方法直接檢測基板的蛋白質(zhì)激酶。種辦法涉及確定激酶基板immunoprecipitating標(biāo)簽的形式突變激酶轉(zhuǎn)染COS - 1細胞,并執(zhí)行一個激酶反應(yīng)增加γ- [標(biāo)記]三磷酸腺苷的模擬。第二中方法涉及除重組突變激酶γ- [標(biāo)記]三磷酸腺苷模擬細胞裂解液。我們使用這些技術(shù)的磷酸化ERK 2基板然而,這種方法可以適用于其他蛋白激酶。

材料方法Ⅰ和Ⅱ,如上)

緩沖器解決方案,和試劑

重組激酶Ⅱ)

[γ- 32 ]三磷酸腺苷的模擬Ⅰ+Ⅱ)

時凝膠瓊脂糖

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

激動劑例如,表皮生長因子血清,血小板衍生生長因子

國旗平方米瓊脂糖珠

十二烷基硫酸鈉20%

平方米裂解緩沖液(二(見議定書1)

公共電視網(wǎng),室溫冰冷的Ⅰ+Ⅱ)(見議定書1)

無血清培養(yǎng)基,例如,貝科的介質(zhì))

旗肽(5毫克/毫升的低滲裂解緩沖液

激酶緩沖區(qū)含有脒,10毫米和100毫米氯化鈉(二

2 Laemm li樣品緩沖

低滲裂解緩沖液

20毫米復(fù)7.4

2毫米

2毫米氯化鎂

細胞的

1細胞Ⅰ+Ⅱ)

質(zhì)粒

maxi-prep DNA質(zhì)粒攜帶的抗原表位標(biāo)記版本的野生型和突變形式的激酶的興趣

特殊設(shè)備

組織培養(yǎng)皿Ⅰ+Ⅱ)

皮下注射針頭的1 / 4,1,27計

提取

透析10000分子量截止Ⅱ)

SDS -聚丙烯酰胺凝膠

旋轉(zhuǎn),設(shè)置在冷藏室(4°丙)

沸水浴,預(yù)設(shè)100°

孵化器,預(yù)設(shè)37°,5%二氧化碳Ⅰ+Ⅱ)

孵化器預(yù)設(shè)30°Ⅰ+Ⅱ)

離心冷卻到4攝氏°(Ⅰ+Ⅱ)

方法

方法磷酸化激酶底物

重要的是規(guī)范的程序在小型反應(yīng)之前,擴大程序識別新型基板。

1×106100毫米1細胞組織培養(yǎng)菜的前1天轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)細胞在37攝氏°5%二氧化碳。轉(zhuǎn)染的細胞與6µ質(zhì)粒攜帶抗原表位標(biāo)記版本的野生型或突變形式的激酶的興趣,和24µ升的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,根據(jù)制造商的指示。

24至72小時posttransfection兩次細胞與室溫硫化鉛serum-starve他們在無血清培養(yǎng)基的4 - 12小時。然后,刺激細胞激動劑5 - 10分鐘。

這取決于激酶正在研究不同饑餓時間和興奮劑可以用。

細胞兩次硫化鉛。添加低滲裂解緩沖液(0.5毫升/ 100毫米菜)

低滲裂解緩沖區(qū)是用來保護蛋白相互作用與相關(guān)蛋白。確定相互作用基板,形成穩(wěn)定的協(xié)會平方米裂解緩沖液(見議定書1)或另一個緩沖區(qū)與濃度的增加洗滌劑或鹽可以用來(哈洛和1999巷。

細胞一起和他們轉(zhuǎn)移到1.5毫升微量管。不要。溶解細胞的15000g微量離心20分鐘在4°C

轉(zhuǎn)移上清~ 1毫克蛋白新管。保持小等分旁白(20µ克)檢查的表達水平的蛋白表達。

時凝膠適量的瓊脂糖(30µ升/樣本)與低滲緩沖液和混合flag-m2瓊脂糖珠(10µ升/樣本),或珠共軛抗體表位標(biāo)記另一個選擇~ 1µ克抗體每1毫克的蛋白質(zhì)裂解液)

混合珠兩次在低滲裂解緩沖液,然后將它們添加到裂解制備步驟5(40µ每樣本)免疫。孵化珠在裂解液1 - 2小時在4攝氏°不斷旋轉(zhuǎn)。

三次免疫沉淀與低滲裂解緩沖液(1毫升每每個樣品。決賽后的清洗,剩下的幾緩沖使用1個1 / 4英寸,27衡量針。

執(zhí)行激酶反應(yīng)總體積

 

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